Três ativistas foram detidos quando seguraram a âncora da balsa, para tentar impedir a saída do porto de Mitilene.
Outras 30 pessoas se reuniram no porto de Lesbos e gritaram frases como "Vergonha para a UE" e "Liberdade para os refugiados".
Nas próximas horas, outro grupo de 80 migrantes deve ser expulso de Lesbos.
De acordo com o governo grego, a operação envolve aqueles que não solicitaram asilo na Grécia.
"Qualquer pessoa que pede asilo sai da lista", afirmou uma fonte do Executivo à AFP.
Segundo os termos do acordo entre a UE e Ancara concluído no mês passado em Bruxelas, todos os imigrantes que chegaram de maneira irregular às ilhas gregas a partir da Turquia a partir de 20 de março correm o risco de expulsão.
O acordo também afirma que para cada refugiado sírio devolvido, a UE receberá outro sírio que está na Turquia, até atingir o limite de 72.000.
Em troca, a Turquia receberá uma ajuda de seis bilhões de euros e no mês de junho será suspensa a exigência de visto aos cidadãos turcos em viagens para a UE.
Na segunda-feira, o primeiro grupo de 202 migrantes foi expulso para a Turquia a partir das ilhas de Lesbos e Quios.
Diante da situação, muitos dos 3.000 migrantes bloqueados em Lesbos correram para apresentar pedidos de asilo, o que obrigou as autoridades gregas a adiar as expulsões para ter tempo de analisar as demandas individualmente.