O ato também foi acompanhado pela chefe da diplomacia da UE, Federica Mogherini, e pelo chanceler cubano, Bruno Rodríguez.
"É um passo histórico em nossa relação", disse Mogherini em espanhol durante a cerimônia.
Cuba era o único país da América Latina que carecia de um acordo de diálogo político com a UE.
Em abril de 2014, o bloco comunitário iniciou as negociações com Cuba, com o objetivo de deixar para trás a "Posição Comum" europeia de 1996, que condiciona a cooperação a avanços em direitos humanos na ilha comunista.
"Este acordo marca o fim da Posição Comum", declarou Mogherini, que antecipou que a UE dará os passos para revogar esta norma.
Em 2003, o bloco europeu suspendeu temporariamente a cooperação com a ilha comunista após a detenção de 75 dissidentes cubanos (já libertados).
Com o acordo assinado nesta sexta-feira, que deverá ser submetido à revisão do Parlamento da UE antes de entrar em vigor, Cuba encerra suas divergências com a Europa antes de receber a visita de Obama, a primeira de um presidente americano em 88 anos.
O presidente estará na ilha entre 20 e 22 de março.
Os governos de Raúl Castro e de Obama restabeleceram os laços diplomáticos bilaterais em 2015 após mais de meio século de inimizade pela Guerra Fria, embora ainda esteja pendente o levantamento do embargo que castiga a ilha desde 1962.